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　　本生解析：操作細胞系步驟以及小技巧

　　脂質體作為體內和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分廣泛，中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA，借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過內吞被導入細胞。

　　一、細胞系方法原理

　　細胞系方法主要包括：電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質體轉染法、病毒介導的轉染等，理想的細胞轉染方法是具有高轉染效率、對細胞的毒性作用小等，本文主要介紹細胞轉染常用的方法-脂質體轉染的原理和操作步驟等。

　　優(yōu)點: 與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復性，它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下蕞方便的轉染方法之一。

　　二、細胞系操作步驟

　　(1) 細胞系培養(yǎng)：取6cm細胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液，37℃ CO2培養(yǎng)密度至40%~60%，密度過大，轉染后不利篩選細胞。

　　(2) 轉染液制備：在EP管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)

　　A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug 質粒DNA。

　　B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質體。

　　分別將A液與B液輕彈混勻，靜置5分鐘。

　　(3) 吸取B液加入至A液中，輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。

　　(4) 轉染準備：用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。

　　(5) 轉染：把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

　　(6) 瞬時轉染后，可在48h-72h細胞長滿之后，提取細胞蛋白或者RNA，驗證敲減/過表達效率。

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