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問題解析:熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線
更新時(shí)間:2024-02-29瀏覽:1266次

  問題解析:熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線


  熒光定量 PCR反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)這個(gè)問題的常見原因,主要可以歸結(jié)為以下幾種:

  反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠:一般建議設(shè)置循環(huán)數(shù)為 40。

  程序中未設(shè)置信號(hào)采集步驟:注意,兩步法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸階段;三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在 72 度延伸階段。

  引物降解:長時(shí)間未使用的引物應(yīng)先通過 PAGE 電泳檢測(cè)完整性,以排除引物降解的可能性。

  模板濃度太低:這個(gè)大家減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)就可以了,一般來說,未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

  模板降解:無解,請(qǐng)重新制備模板,可以重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

  溶解曲線形狀異常

  (1)雜峰在主峰之前,Tm 約為 70 - 75℃——一般為引物二聚體


656.png


  這種情況主要有三個(gè)解決方法:

  重新設(shè)計(jì)引物;

  雜峰為引物二聚體,熒光定量 PCR引物二聚體主要是由于體系內(nèi)引物與引物糾纏比引物與模板結(jié)合更容易導(dǎo)致的,可以嘗試提高模板濃度、退火溫度或者降低引物濃度來進(jìn)行改善;

  另外,當(dāng)目的基因表達(dá)量極低時(shí),染料法容易形成引物二聚體產(chǎn)物影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,此時(shí),建議使用探針法定量。

  (2)雜峰在主峰之后,非引物二聚體

  上圖這種情況就是非特異性擴(kuò)增,可能是引物特異性不好引起的,也可能是空氣中有氣溶膠污染所導(dǎo)致。

  大家可以先增加退火溫度再試試看,如果沒有改善,那么就需要重新更換引物啦。

  為了避免這種麻煩,BUNSEN本生小編建議大家在進(jìn)行熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)之前,就對(duì)自己的引物做一個(gè)特異性驗(yàn)證。另外,每次試驗(yàn)的 NTC(no template control)是一定要做的。

  (3)只有引物二聚體,無目的條帶

  如果擴(kuò)增片段過短(小于 80bp),那么僅通過融解曲線就很難區(qū)分引物二聚/目的條帶。

  另外,也有可能是 熒光定量 PCR 擴(kuò)增效率低或者沒有擴(kuò)增,體系里邊只有引物糾纏成的二聚體了。

  總之,產(chǎn)物長度建議大家還是設(shè)置在 100 - 200 bp,不要太短了。

  注:以上資料僅供參考!

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